奶粉中维生素B12试剂盒检测方法及注意事项

简介：

维生素B₁₂又叫钴胺素，是维一含金属元素的维生素。自然界中的维生素B₁₂都是微生物合成的，高等动植物不能制造维生素B₁₂。维生素B₁₂是维一的一种需要一种肠道分泌物（内源因子）帮助才能被吸收的维生素。有的人由于肠胃异常，缺乏这种内源因子，即使膳食中来源充足也会患恶性贫血。植物性食物中基本上没有维生素B₁₂。它在肠道内停留时间长，大约需要三小时（大多数水溶性维生素只需要几秒钟）才能被吸收。维生素B₁₂的主要生理功能是参与制造骨髓红细胞，防止恶性贫血；防止大脑神经受到破坏。

原理：

CLOVER VB12试剂盒的测定是基于免疫学中抗原抗体特异性反应的原理而建立的。微孔板包被有VB₁₂抗原。加入VB₁₂抗体和VB₁₂标准品或样品提取液。标准品或样品中提取的VB₁₂能与酶标板上的VB₁₂包被原竞争性地结合定量的抗体，没有结合的抗体、标准品或样品中提取的VB₁₂在洗涤步骤中被除去。再加入酶标二抗与微孔中的VB₁₂抗体反应。洗涤除去没有反应的酶标二抗。加入底物溶液温育，酶标记物将无色的显色剂转化为蓝色的产物，加入终止液后颜色由蓝色转变为黄色，在450nm 处测量每孔的OD值。OD值与样品中的维生素B₁₂含量成反比。

奶粉前处理:

1)         称取1.0g奶粉样品于50mL离心管中，加入9mL 50℃纯净水溶解，即位复原乳样品。

2)         取1mL复原乳样品到1mL离心管中，4℃ 3000r/min离心10分钟。

3)         去除上层脂肪层，转移出100μL中层奶液至一洁净的离心管中，加入稀释缓冲液500μL，涡旋混匀待检（1 份上层液＋5份稀释液）。

4)         取50μL 进行分析。

试剂盒操作：

1)         取所需量的微孔板条装在酶标板框架上。

2)         分别吸取50μL标准品和样品加至相应的微孔（双孔）中，再各加入50μL的抗体，加盖，室温（25℃）温育30分钟。

3)         倒出孔中的液体，每孔加入250μL稀释好的洗涤液洗涤，重复操作四次。

4)         每孔加入酶标二抗100μL， 室温（25℃）温育30分钟。

5)         重复步骤3，反复洗涤四次。

6)         每孔加入100μL显色底物，室温避光温育10分钟。

7)         每孔加入50μL终止液，混匀。

置于酶标仪中，振荡混匀，在450nm处测定吸光度值（OD值），参比波长630nm。（iELisa全自动酶标仪可以直接读出、打印浓度值）

注意事项

1)         室温低于20℃或试剂及样品未回到室温（20- 25℃）会导致数值偏低。

2)         在洗板过程中如果出现板孔干燥过久的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3)         标准物质和显色液对光敏感，避免直接暴露在光线下。

4)         混合要均匀，洗板要彻低（包括加样品和标准液的时候都必需充分混合均匀）。

5)         终止液为强酸性物质，避免接触皮肤。

6)         不要使用过了有效期的试剂盒，也不要使用不同批次的试剂盒，这样会引起测定误差。