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肝素亲和柱-HPLC法测定乳品中的乳铁蛋白

发布时间:2022-05-31      点击次数:77

肝素亲和柱-HPLC法测定乳品中的乳铁蛋白


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什么是乳铁蛋白?

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乳铁蛋白可以响应各种生理和环境的变化,因此它被认为是先天防御系统的关键组成成分。乳铁蛋白对多种细菌、真菌、酵母、病毒和寄生虫表现出强大的抗菌活性。它还具有抗炎和抗癌活性,并具有多种酶功能。乳铁蛋白在维持体内细胞铁水平中起关键作用。

乳铁蛋白添加量并不是越高越好,如果婴幼儿配方奶粉中乳铁蛋白含量过高,长期饮用会导致宝宝摄入过量的铁,易引起铁中毒,另外体内乳铁蛋白含量过高时还有可能会增加肾脏负担。

国家卫生部2012-3-15颁布实施的《GB-14880-2012食品安全国家标准食品营养强化剂使用标准》明确规定了食品中的添加剂量,每100g≤100mg。

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肝素亲和柱简介

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另有肝素亲和柱Heparin HP专用柱

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使用对象

IAC-SEP肝素亲和柱能够特异性的纯化样品中的乳铁蛋白,它广泛的应用乳制品样品的净化,该方法速度快、操作简单、准确性高,对提高乳制品的质量和安全性起到十分重要的作用。

原理

肝素亲和柱能够特异性的纯化样品中的乳铁蛋白,样品前处理后,通过亲和柱净化,乳铁蛋白特异性吸附在亲和柱上,用淋洗液将亲合柱上的杂质除去,用洗脱液通过分离柱,将乳铁蛋白亲和柱上分离下来,最后,将洗脱液注入HPLC或LC-MS进行测定。

样品前处理:

1、液体奶样品:

  • 牛初乳乳铁蛋白参考含量1-2mg/g,建议称量2-5g.

  • 普通牛奶中乳铁蛋白参考含量小于0.5mg/g,建议称量10-20g.

称取 1-20g样品(根据需要的检测范围确定称量多少),置于50 mL离心管中。将20-30mL 结合缓冲液加入到离心管中,震荡混匀;将混匀样品转移至50mL容量瓶中,用结合缓冲液定容至50mL,摇匀。将样本4℃条件下10000 RPM离心10 min,准确吸取中间层液体10mL,作为上样液。或采用微纤维过滤,准确吸取滤液10 mL,作为上样液。


2、固体样品:(婴幼儿配方奶粉、乳粉等)

称取 4g(精确至0.01 g)试样,置于250 mL 烧杯中。将70 mL 已预热到40 ℃的结合缓冲液加入到样品中,用玻璃棒将其混合均匀,并溶解。将样品移入100 mL 容量瓶中,用少量的结合缓冲液分次洗涤烧杯,洗涤液一并移入容量瓶中,用结合缓冲液定容至刻度,摇匀后分别移至两个50 mL离心管中,在4℃条件下10000RPM离心10 min,准确吸取中间层液体10mL,作为上样液。或采用微纤维过滤,准确吸取滤液10 mL,作为上样液。


3、液相色谱条件

色谱柱:Cloversil XB-C4, 5μm, 300Å, 4.6×250mm

流速:1.0 mL/min

检测器:紫外检测器,280nm

进样体积:50uL

流动相:0.1%三fu乙酸与乙腈梯度洗脱,

见下表

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高效液相色谱仪检测乳铁蛋白标准谱图如下:

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需要准备的设备及试剂(中检维康提供)

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