中检维康黄曲霉毒素ELISA试剂盒

 中检维康iELisa黄曲霉毒素ELISA试剂盒

1. 概要

2. 黄曲霉毒素是一类真菌（如黄曲霉和寄生曲霉）的有毒的代谢产物，它们具有很强的致癌性. 黄曲霉毒素M<苏b>1是黄曲霉毒素B<苏b>1的代谢产物。经摄入含有黄曲霉毒素B<苏b>1饲料的奶牛产出的牛奶中，其中便含有黄曲霉毒素M<苏b>1。由于黄曲霉毒素M<苏b>1相当稳定，巴氏灭菌法也无法将其杀灭，所以检测黄曲霉毒素M<苏b>1不仅要在饲料原料中检测，而且在终产品中的含量也需要进行测定。用iELisa 黄曲霉毒素M<苏b>1快速检测试剂盒可以准确地检测牛奶、酸奶、奶酪和奶粉中的黄曲霉毒素 M<苏b>1。

3. 原理

4. 本产品是利用抗体-抗原免疫反应检测原理建立的一种定量检测试剂盒。加入黄曲霉毒素M<苏b>1（AFLA M<苏b>1）标准品或样品后，黄曲霉毒素M<苏b>1与微孔中的抗体相结合。洗去没有结合的黄曲霉毒素M<苏b>1，加入酶标抗原，与黄曲霉毒素M<苏b>1与抗体没有结合的部位相结合。洗去没有结合的酶标抗原，加入TMB底物显蓝色，加入终止液后颜色由蓝变黄，用酶标仪在450nm处检测，吸光值与样品中黄曲霉毒素M<苏b>1含量成负相关，与标准曲线比较即可得出黄曲霉毒素M<苏b>1的含量。

   3. 试剂盒的组成

5. 包被有抗体的96微孔板：1块（96 孔，12 条×8 孔）
6. AFM1标准品：0 ng/mL 、0.05 ng/mL、0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL：

7. 1 瓶 × 1.0mL                   

8. AF-M1酶标抗原：            1 瓶 × 15mL
9. 10× 浓缩洗涤液：            1 瓶 × 50mL
10. AF-M1稀释缓冲液:           1 瓶 × 50mL
11. 显色底物液：                1 瓶 ×12mL
12. 反应终止液：                1 瓶 × 13mL
13. 试剂盒说明书
14. 质控报告
15. 需要的仪器、试剂

16. 1）仪器

17. 酶标仪450nm（iELisa全自动酶标仪或相当者）
18. 微量移液器：20μL-200μL单道，100μL-1000μL单道, 50μL-300μL八道
19. 高速离心机
20. 酶标板振荡器
21. 涡旋混合器
22. 振荡器
23. 蒸发设备、恒温箱
24. 100mL量筒
25. 计时器
26. 天平：感量0.01g
27. 离心管1.5mL、50mL

28. 2）试剂

29. 甲醇、正庚烷、二氯甲烷
30. 样品处理

31. 5.1 牛奶：

32. 取牛奶1.0 mL样品，用离心机（4000RPM）离心10min.。
33. 离心后用移液器*去除上层奶油。
34. 取200μL下层脱脂牛奶，加入200μLAF-M<苏b>1稀释缓冲液（1:1）稀释。

35. 稀释倍数：2

    5.2 酸奶：

36. 取酸奶样品2.0g，用离心机（4000RPM）离心10分钟。（如没有冷冻离心机，可将样品先冷却到10℃，再离心）
37. 离心后，取200μL上层澄清液于1.5mL离心管中，加入200μL AF-M<苏b>1稀释缓冲液（1:1）稀释，涡旋混合器混匀。

38. 稀释倍数：2

    5.3 奶粉：

39. 用天平称取2.0g奶粉到锥形瓶中，再加入10mL 50℃左右的纯水（复原乳）。
40. 用力振荡3分钟.，使充分溶解。
41. 按照5.1牛奶样品处理步骤进行。

42. 稀释倍数：10 （检测范围：0.5---5 ppb）

    5.4 奶粉（高灵敏度）：

43. 用天平称取2.0g奶粉到锥形瓶中，再加入5mL 50℃左右的纯水（复原乳）。
44. 用力振荡3分钟.，使充分溶解。
45. 按照5.1牛奶样品处理步骤进行。

46. 稀释倍数为5（检测范围：0.25---2.5 ppb）

    5.5 奶酪：

47. 用天平称取2.0g粉碎的奶酪放入离心瓶中，加入40.0mL二氯甲烷，充分溶解混匀后，剧烈振荡15分钟.。
48. 过滤，取10.0mL，60℃氮气吹干。
49. 分别加入0.5mL甲醇、0.5mL PBS、1.0mL庚烷，复容。
50. 3000转/分钟离心15分钟.。
51. *去除上层庚烷。
52. 取100μL下层提取液于1.5mL离心管中，加入400μL AF-M<苏b>1稀释缓冲液（1:4）稀释，涡旋混合器混匀，取100μL用于检测。

53. 稀释倍数：10

    6． 酶联免疫分析程序

    6.1测定之前注意事项

54. 使用前将所有试剂平衡至室温（20-25℃）。
55. 使用后迅速将试剂放入2-8℃冷藏。
56. 在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。
57. 所有温育过程应避免阳光直射，并按要求用盖板覆盖住酶标板。

58. 6.2溶液的配制

    洗涤液的配制：将浓缩洗涤液用纯水稀释10倍后使用。（例如：取10 mL 浓缩液+90 mL纯水, 可以用于32孔的检测）。

    6.3测定程序

59. 将足够标准品和样品所用数量的孔条插入酶标板架，标准品和样品做两个平行实验，记录下标准和样品的位置。未使用的酶标板用铝箔袋封好置2-8℃冷藏保存。
60. 分别吸取100μL标准品和样品加至相应的微孔（双孔）中,，加盖，室温抚育50分钟.。
61. 倒出孔中的液体，每孔加入250μL稀释好的洗涤液，置于酶标板振荡器上振荡30秒（或者手工振荡），重复操作四次。洗完后用力在吸水纸上拍干。
62. 每孔加入AF-M<苏b>1酶标抗原100μL，加盖，室温抚育30分钟.。
63. 倒出孔中的液体，每孔加入250μL 稀释好的洗涤液，置于酶标板振荡器上振荡30秒（或者手工振荡），重复操作四次。洗完后用力在吸水纸上拍干。
64. 每孔加入100μL显色底物液，加盖，室温抚育10分钟.。
65. 每孔加入50μL反应终止液。
66. 置于酶标仪中，振荡混匀，在450nm处测定吸光度值（OD值），参考波长630nm。（iELisa全自动酶标仪可以直接读出、打印浓度值）

67. 7.  结果判定

68. 所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以di一个标准（0标准）的吸光度值（B<苏b>0）再乘以100%，即百分吸光度值。

69. 百分吸光度值（%）＝	B	×100%
    	B<苏b>0

    以黄曲霉M1标准品浓度值（ppb）为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。相对应每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。也可以用回归方程法，计算出样本溶液浓度。利用计算机专业软件，更便于大量样品的快速分析。

70. 样品的实际浓度为读数结果乘以相应稀释倍数。
71. 如果测定值超出检测范围，样品提取溶液按一定的比例用阴性牛奶样品进行稀释。

72. 8.  注意事项

73. 室温低于20℃或试剂及标本未回到室温（20- 25℃）会导致数值偏低。
74. 在洗板过程中如果出现板孔干燥过久的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板排干后应立即进行下一步操作。
75. 标准物质和显色液对光敏感，避免直接暴露在光线下。
76. 混合要均匀，洗板要*（包括加样品和标准液的时候都必需充分混合均匀）。
77. 反应停止液为强酸性物质，避免接触皮肤。
78. 不要使用过了有效期的试剂盒，也不要混合使用不同批次的试剂盒，这样会引起测定结果不准确。
79. 试剂盒的储存条件是2-8℃，切勿冷冻。

80. 9.  检测方法灵敏度、准确度、精密度

    1）试剂盒灵敏度: 0.05ppb

    2）检测范围：牛奶0.1---1.0 ppb

                 酸奶0.1---1.0 ppb

               奶粉0.5---5.0ppb；0.25---2.5 ppb

      奶酪0.5---5.0ppb

    3）试剂盒变异系数：小于20%。

    4）试剂盒准确度：回收率范围在70%-120%之间。